• 被称为下二代序 (NGS) 的大规模平行测序技术已经改变了生物学研究,提供了无与伦比的数据采集水平,刺激了基因组学领域,并革新了遗传基础的研究潜力。随着可用技术的增多和成本的降低,基于 NGS 的研究和应用将继续增长。Bioline 系列样品制备和 DNA 预处理试剂旨在利用 Illumina NGS 平台最大限度地提高产量和后续 NGS 数据质量,促进在此领域进行有活力和不断发展的研究和应用工作。

    测序技术的发展

    自早期的基于凝胶的双脱氧核苷酸技术之后,测序方法已取得极大的进展。传统的测序方法被称为 Sanger 测序,由 Frederick Sanger 与其同事在 70 年代后期共同开发。

    使用终止延伸的正常和化学修饰核苷酸的混合物获得核苷酸特异性测序片段,从而产生一定范围的片段长度,然后可以进行分离(最初通过凝胶,之后通过柱分离),随后从最短片段“读”到最长片段以确定总体靶序列。相比而言,下一代测序 (NGS) 方法基本上同时进行测序和检测,通常在一个介质中进行,允许在单次仪器运行中测序数千甚至数十亿个反应。NGS 被称为大规模平行测序,可产生庞大的数据集,正被用于生物研究和应用科学的所有领域。

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    NGS – 技术考虑

    每个 NGS 平台均使用不同的方法、化学品和介质,但所有平台都需要将目标 DNA 预先制备成序列就绪文库。

    高分子量 DNA 必须剪切成合适的大小,并与平台特异性接头连接,以启动测序过程。Bioline 提供的 JetSeq™ DNA Library Preparation Kit 兼容 Illumina 测序平台,旨在简化制备流程 - 提供单管方案,缩短获得结果的时间,同时最大限度地提高产量和随后的序列覆盖率。

    NGS 工作流程的另一端是数据处理步骤。为每次 NGS 运行生成数万亿字节的原始数据,然后执行一系列预处理、对比和组装步骤。由 NGS 获得的读长在 50-500 个核苷酸范围内,大大短于 Sanger 的读长,因此为了确保准确的序列组装,适当数量的重叠短读段(称为覆盖度)是重要的质量特征。可以成功组装并与参考序列匹配的短读段序列被称为“可定位读段”,文库制备的质量可以直接影响该数量。所需读段数量取决于总体实验要求。分析罕见的转录物或从头基因组组装需要更大的读深和覆盖度。

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    NGS – 应用

    NGS 已应用于几乎所有的生物学研究领域,在全基因组测序和重测序领域表现卓越,可以鉴别参考序列之间的差异,从而更好地了解基因型/表现型关系。

    没有参考基因组的生物体也受益于 NGS 的快速方法,越来越多的从头装配基因组序列现在正被添加到数据库中,从模式生物体到濒危物种,甚至已经灭绝的物种(例如猛犸象和早期人类)。

    宏基因组学是 NGS 应用的一个不断发展的领域,可以分析环境或医学样品中的所有 DNA,从而全面了解栖息微生物组的复杂性。可以在健康个体和受影响个体之间进行比较,例如使用来自人类肠道的样品,努力确定与特定表现型(例如肥胖症或肠易激综合征)的关联。全基因组关联研究也被用于大规模鉴定致病基因以及将 DNA 与表现型进行功能性关联。使用 NGS 进行转录组测序是研究基因表达的另一种方法,可以提供样品内 RNA 转录物的可定量快照。

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