• 研究生物世界的复杂细节需要使用工具有效和灵敏地分离组成这些系统的各个元件。几乎每个分子生物学工作流程都从提取步骤开始,以便分离目标分子(DNA、RNA、蛋白质)用于下游的纯化、扩增或操作应用。Bioline 提供一系列经过专门制备的核酸纯化试剂,为您的工作流程中的这个常规但非常重要的步骤提供精简、灵敏和稳健的选择方案。

    核酸纯化的基本概念

    您提取的核酸的质量和完整性将直接影响所有后续实验和下游结果。具体方案将根据起始样品类型和感兴趣目标而变化。

    成功的核酸分离工作流程的基础涉及许多关键步骤:

    • 有效破坏生物基质(细胞、组织、环境或生物样品)以释放核酸
    • 对与核酸(核蛋白)相关的结构蛋白进行变性处理
    • 对降解分离产物(RNase 和/或 DNase)的核酸酶进行灭活处理
    • 去除污染物(蛋白质、碳水化合物、脂质、生物或环境元件、不需要的核酸、其他细胞碎片)

    使用化学和/或物理方法进行初始破坏,使样品基质均质化并破坏细胞壁,从而释放核酸以及其他细胞成分。DNase 活性的破坏相对容易,因此 DNA 分离属于相当简单的技术。另一方面,RNase 无处不在且非常稳定,因此有效和灵敏的 RNA 提取方法依赖于良好的实验室技术,应使用不含 RNase 的设备和适当的方案进行有效的 RNase 灭活。

    传统的核酸提取技术使用苯酚-氯仿等有机溶剂将核酸从蛋白质、碳水化合物和细胞碎片(这些物质会溶解到水相中)中分离出来。然后进行离心以收集亲水的含核酸层,接着进行醇析以回收核酸。调节溶液的 pH 并加入合适的添加剂(例如异戊醇和硫氰酸胍),从而分离 RNA 同时将 RNase 灭活。始终需要多次酒精洗涤步骤才能去除影响下游应用的高含量盐。

    商业化核酸提取技术在很大程度上放弃了通常耗时的沉淀方法,转而采用通常以旋转柱形式进行的固相提取。这些二氧化硅基质和其他阴离子交换材料随着 pH 和盐含量的变化而改变对核酸的亲和力,通过结合离心力,柱基提取工作流程极大地简化了所需的各种吸附、洗涤和洗脱步骤,从而实现无污染物的高质量提取,适用于大部分下游应用。

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    样品类型和特殊考虑事项

    大多数分子生物学技术依赖于不含生物和环境污染物的高质量核酸起始材料。

    过量的盐、各种有机和无机物质以及提取处理步骤中的残留物质都可能存在于提取的最终产物中,并有可能干扰下游应用的化学和过程。在确保严格遵循核酸提取工作流程的同时,不同的样品类型可能需要进行特殊处理,以确保所得的提取物不含潜在的抑制物质。

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    细胞、质粒和简单组织

    从细胞培养物中提取是最直接和最常用的核酸来源之一,许多方案已经发展为通过单管或“粗裂解”方法获取可用的核酸。

    通常情况下,细胞培养物和简单组织样品中的核酸浓度较高,而生物培养基中的潜在抑制物质含量较低,因此终点稀释或使用专门配制的酶可使下游应用的功效最大化,不需要多次洗涤步骤。Bioline 的 MyTaq™ Extract PCR Kit 可高效简化细胞培养物和哺乳动物实体组织样品(例如鼠尾或鼠耳)的常规 DNA 提取,通过单步方案获得高产量、可直接进行 PCR 的模板。

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    生物样品和石蜡包埋组织

    对于核酸浓度较低、基质较复杂和可能含有较多抑制物质的样品,建议采用更复杂的工作流程,以最大限度地提高灵敏度,并最大限度地减少抑制性残留。

    大多数生物样品可以采用类似的方式处理,这将简化实验室工作流程。Bioline 的 ISOLATE II Genomic DNA Kit 就是这样一种多用途的柱基方法,其可以从各种生物样品(包括口腔拭子、活组织切片、毛发、石蜡包埋组织以及病毒、酵母和细菌样品)快速高效地提取基因组 DNA。

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    血液和粪便样品

    一些生物样品含有独特的组分,可能需要采用专门的方案以确保所得的核酸不含这些抑制性污染物。

    例如,血液中的血红蛋白以及其他血液蛋白质、免疫球蛋白、激素等是已知的 PCR 抑制剂,因此这些样品可能需要进行专门的处理。Bioline 的 ISOLATE II Blood DNA Kit 经专门制备用于应对这些污染物以及处理过程中引入的其他潜在物质(例如 EDTA、肝素或柠檬酸盐等)。粪便样品也可能造成高浓度的脂质、盐和复合多糖。Bioline 的 ISOLATE II Fecal DNA Kit 经专门制备用于克服这些挑战。

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    植物和土壤

    环境样品带来了一系列独特的问题,例如腐殖酸、金属离子和其他有机和无机碎屑,使提取过程变得复杂。

    从植物中提取的核酸不得含有高浓度的果胶、多糖、木聚糖和多酚,这些都可能具有下游抑制作用。ISOLATE II Plant DNA Kit 旨在从来自土壤、植物组织(包括树皮)、堆肥甚至粪便的广泛环境样品中去除这些抑制剂。

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    PCR 产物和凝胶

    一些方案需要进行纯化而非提取,例如清除 PCR 产物,或从琼脂糖凝胶中分离目标核酸。

    ISOLATE II PCR and Gel Kit 是一种快速便捷的解决方案,可提供高回收率和高质量的最终产品,适用于克隆、测序或限制性分析等一系列下游应用。

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    微小核糖核酸 (miRNA)

    自 20 多年前被发现以来,miRNA 在之前受到忽视,被视为非功能性基因组成分,而现在被认为是重要细胞功能的关键调节因子。

    异常表达的 miRNA 是许多疾病(包括癌症)的标志。有效的 miRNA 分析需要可重现、灵敏和特异性的工具,且周转时间应足够快,以便支持对可能快速变化的疾病进展和治疗环境进行调查。

    尽管大多数传统 RNA 分离方法在回收 miRNA 方面效率不高,但 ISOLATE II 试剂盒能够从各种样品类型(包括哺乳动物组织、培养细胞、血液、生物体液、病毒、细菌、FFPE 和植物组织)中快速、无偏差、无苯酚地回收 miRNA。

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