• 基因表达分析旨在研究从编码基因形成基因产物的事件或活动。它是生物活性的敏感指标,其中生物学过程的变化反映了基因表达谱的变化。基因表达谱分析不仅仅是基因组序列的静态信息,更是对生物体生物学的动态功能性观察,并且是一种在研究、临床和药物领域中广泛使用的方法,可以更好地了解个体基因、基因通路或更深入的基因活性概况。基因表达分析可以通过各种方法来实现,然而实时 PCR 已上升为最常用的方法,Bioline 产品组合中的系列产品可以很好地支持这些研究。

    基因表达 - 方法和技术

    基因表达分析通常涉及分离或采集样品中的转录 RNA,之后是扩增和后续的检测和定量。

    基因表达系列分析 (SAGE) 等绝对定量技术采用了标签,通过标签总数计算给定序列的标签数量以获得基因产物的总体丰度。微阵列在大规模的基因表达分析比较中也非常受欢迎,可以同时比较数以万计的目标。最常用的方法是将代表目标条件的样品的表达谱与参考样品中相同的基因集进行比较,从而计算两个群体之间的相对表达水平。这种高通量的方法可以对基因通路或疾病相关基因家族进行大规模筛查,在疾病预后研究中被证明是有用的方法,或者可以在药物研究中预测化学物质或药物对生物过程的影响。使用下一代测序 (NGS) 技术 RNA-Seq 的基因表达分析正在不断普及,其能够测量和比较数百万个随机位置读段,随后定位和对齐到每个基因,以前所未有的详细程度进行基因表达的测量。

    为了验证高通量基因表达分析以及分析中等数量的基因,实时逆转录酶 PCR (RT-qPCR) 是首选方法,其可以准确地相对定量(或在某些情况下绝对定量)样品中的 cDNA,代表了感兴趣目标的基因表达水平。Bioline 提供全方位的样品制备(cDNA 合成和 qPCR 试剂)以及定制检测设计服务,以协助 RT-qPCR 基因表达分析研究。

    了解更多

    使用 qPCR 的基因表达 – 技术考虑

    尽管 RT-qPCR 被认为是准确测量基因表达的黄金标准,但 RT-qPCR 数据的真实准确性和后续可用性在很大程度上取决于实验设计、总体工作流程和分析技术。

    整个工作流程中存在许多关键问题,例如样品选择和处理、使用适当的对照和计算方法以及总体实验设计和报告策略。一些关键要素概述如下。然而,Bioline 建议根据 MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) 指南1进行合适的 RT-qPCR 实验设计。

    了解更多

    实验设计

    除了使用适当数量的重复样品获得统计显著性外,有效的基因表达分析必须确保对比样品对所研究的生物学问题具有意义。

    除了标准阳性、阴性或扩增内标对照外,其他对照的整合必不可少,包括运行间校准方法、样品提取和完整性对照、扩增前对照以及对用于数据标准化的参考基因的适当验证。

    了解更多

    数据标准化

    鉴于 RT-qPCR 方法的灵敏度,被测样品之间的真实生物学变异以及整个实验过程中引入的技术变异将导致需要最终计算基因表达变异。

    因此,选择参考基因来表示两个样品之间的稳定表达水平并用于标准化结果,并且有望从最终计算中去除技术变异。选择稳定表达的参考基因对于基因表达实验的成功至关重要,给定实验的正确基因将取决于一系列变量,包括被研究的生物体、被采样的组织类型和整体实验条件。一组参考基因(而不是单个候选参考基因)是最好的做法,可以进行更可靠的定量。

    了解更多

    数据分析和报告

    从 RT-qPCR 实验获得的结果为对数值,需要转换成相对于校准品或参考样品的线性数量。

    可供选择的模型、软件程序和计算方法有多种,包括将不同于假定的 100% PCR 效率的反应效率考虑在内的选项。结果可能会有所不同,具体取决于所选的计算方法以及用于标准化的参考基因数量或类型。一旦计算出相对表达水平,就需要进行适当的统计分析,以确保从数据中得出的任何结论有效且具有生物相关性。

    了解更多

    基因表达 - 应用

    基因表达分析的最常见用途是比较不同样品中的一种或多种基因的表达水平。

    有趣且常见的比较包括:

    • 正常与疾病
    • 突变型与野生型
    • 治疗前与治疗后
    • 在开发期间或整个治疗方案中的时间进程
    • 器官、组织或其他样品类型中的空间变异

    随着研究的进展和方法的改进,可以获得更准确的与特定状态相关的表达谱图片,基因表达分析正在从研究领域转向临床领域。此外,通过将不断增长的单核苷酸多态性 (SNP) 数据与基因表达变异分析相结合,可以获得更全面的表现型图片。随着高通量技术应用的提高以及数据分析程序对日益复杂的生成数据的持续管理,基因表达分析的未来应用只会进一步改善。

    了解更多

    1. The MIQE Guidelines: (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) Guidelines. S. Bustin et al, Clinical Chemistry 55:4, 611-622 (2009)