• 基因克隆和载体构建是分子生物学中最常用的一些技术。将 DNA 短片段或完整基因插入质粒或病毒染色体中,然后在细菌或真核宿主中复制,随后进行分离,从而可以对目标基因进行下游测序/表征或对基因表达/蛋白质生成进行研究。无论您的需求如何,Bioline 都能提供范围广泛的克隆试剂,以专业的方式制备目标基因,同时能提供一系列适合具体应用的感受态细胞,所有这些产品都能通过严格的质量控制实现高效的转化,从而获得可重现的结果。

    克隆的基本步骤

    有多种方法可用于克隆 DNA,大部分都遵循以下基本工作流程:

    • 分离目标 DNA - 通常称为“插入物”
    • 将插入物连接到选定的载体中,形成重组分子 - 载体通常为细菌质粒或病毒染色体
    • 将重组分子转化到用于进行增殖的合适宿主中 - 通常称为“感受态细胞”
    • 筛查并选择含有重组分子的增殖宿主用于随后的插入物分离

    将片段或插入物连接到选定的载体中需要酶的作用,T4 DNA 连接酶是最常见的选择。Bioline 已制造出含有专门开发的缓冲液的 Quick-Stick T4 DNA 连接酶,以改善酶活性并提高连接步骤的效率。

    成功的载体必须能够合并插入的 DNA 片段并保留复制功能。合适的宿主必须能够接受载体、保持活力并继续复制,从而增殖出含有目标插入物的克隆体。转化细胞通常处于生长缺陷状态,因此载体具有选择性特征(例如抗生素耐药性),导致只有含有载体的克隆体能在选择性培养基上生长。感受态细胞宿主的另一个特征是具有指示阳性插入物克隆的机制。Bioline 提供的所有感受态细胞均含有 X-gal 蓝色/白色菌落选择基因。

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    克隆策略与载体选择

    如何选择合适的克隆策略和载体/宿主将取决于多种不同的因素:

    • 插入物大小
    • 期望的转化后拷贝数/预期的下游应用(纯化/测序或蛋白质表达/生成)
    • 载体中的克隆位点数目/与插入物中的限制位点的相容性
    • 产生的蛋白质在宿主中的相容性(如果插入物是全基因片段)
    • 感受态细胞的选择性机制

    DNA 来源和插入物制备

    如果使用基因组 DNA,则使用限制性内切酶 (RE) 来获得具有可被克隆的大小的片段 – RE 通常可识别 6-8 个连续碱基。

    大多数 RE 可留下碱基突出端或“粘性末端”,从而可以与 T4 DNA 连接酶进行更有效的连接。Bioline 载体含有多个与大多数 RE 相容的克隆位点。如果使用来自真核细胞的基因组 DNA,则它可能会被严重甲基化,因此为了不降解插入物,所选的载体/宿主必须是 mcr 突变体 – Bioline 为这些情况提供了一系列这样的细胞。

    许多克隆应用采用特定基因或目标区域的 PCR 产物,这些产物可以是平末端(如果使用具有校正能力的 DNA 聚合酶),或者具有 A 突出端(如果使用非校正 Taq 或 Tht 聚合酶)。在 PCR 过程中将核苷腺苷加到扩增子的 3’ 末端是克隆工作流程中经常使用的典型方法,这样可避免额外使用 RE 及多种包含相容 T 突出端的载体,从而实现精简和高效的连接。

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    质粒、噬菌体或 F’ 附加体载体

    细菌质粒是克隆载体的常用选择,因为其含有复制所需的所有遗传因子,并易于从转化细胞中分离出来用于下游应用。

    质粒通常可以有效地携带长度为 5-10 kb 的插入物,且某些质粒经过专门制备可携带最长约 15 kb 的较大插入物。对于需要较大插入物的应用,通常采用噬菌体载体。λ 噬菌体载体通常可携带最长 24 kb 的插入物并且在大肠杆菌感受态细胞中具有更高的转化效率(高 10-100 倍),然而与质粒分离相比,下游分离更为复杂。

    质粒通常可以有效地携带长度为 5-10 kb 的插入物,且某些质粒经过专门制备可携带最长约 15 kb 的较大插入物。对于需要较大插入物的应用,通常采用噬菌体载体。λ 噬菌体载体通常可携带最长 24 kb 的插入物并且在大肠杆菌感受态细胞中具有更高的转化效率(高 10-100 倍),然而与质粒分离相比,下游分离更为复杂。

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    感受态细胞特征

    市场上的大多数感受态细胞为化学感受态细胞,其经过盐洗涤处理,从而破坏细胞膜以方便摄取载体。

    使用化学感受态细胞的优势在于不需要专门的设备,但是用电穿孔设备处理的细胞(电感受态细胞)具有较高的转化效率。

    Bioline 提供的所有感受态细胞均为重组和内切酶缺陷型,提高了载体稳定性和转化效率,并且均可用于 X-gal 介导的蓝色/白色菌落选择。在蓝色/白色菌落筛选中,含有插入物的载体会破坏 β-半乳糖苷酶活性并且不能将 X-gal 培养基转变为蓝色,因此阳性克隆将呈现为白色菌落,而没有插入物的转化细胞会生长成蓝色。

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    克隆应用

    DNA 克隆可获得许多分子生物学工作流程所需的前体,提供了一种机制来产生大量的特定 DNA 片段,可用于各种研究和应用科学用途。

    人类基因组测序项目采用了由随机片段化基因组 DNA 构建的大规模 DNA 克隆文库,这些基因组 DNA 经过数轮的双脱氧测序。这种被称为“鸟枪法”的测序方法允许将多个重叠的读段组装成连续的长读段,从而最终确定全基因组序列。基因克隆和 DNA 克隆文库仍将是使用下游测序技术表征群体、基因组或特定目标基因的有效方法。

    克隆工作流程也可用于支持基因结构和生物活性的研究,例如使用定点诱变来改变基因性质或功能。将含有所需突变的合成基因拷贝用作插入物并克隆,以产生多个突变基因拷贝用于下游应用。DNA 克隆也可用于蛋白质生成,尽管在实践中由于折叠、稳定性和转运的特殊要求,为活性蛋白质生成提供合适的条件非常复杂。

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    我们完整的克隆产品组合包括:

    感受态细胞

    克隆试剂